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       化妝品挑戰性試驗就是用來測定防腐劑有效抗菌的最低濃度,是用來決定化妝品配方中防腐劑的用量,無論是化妝品新配方的開發或現有的產品,以及新防腐劑的開發使用,均應作防腐效能試驗。防腐效能試驗是在化妝品樣中加入微生物,根據微生物的存活和增減的數量來判定所加防腐劑的量是否合適。

        所有的化妝品在生產和消費者使用過程中都面臨著受到微生物污染的可能。大多數化妝品的制造原材料不是無菌的,但生產過程中沒有采用無菌程序,沒有滅菌過程,而且常常裝在多次使用過的包裝容器內,這就可能造成微生物的一次污染。大多數化妝品具體營養成分和水分利于微生物生長和繁殖的條件,當有足夠的水分和營養成分存在時,產品除非有適宜的防腐劑存在,否則微生物將會迅速繁殖,脫水產品如眼影、粉底、礦物油等雖然沒有微生物生長所必需的水分,但它們在反復的使用過程中都有被二次污染的可能。二次污染是很難避免的,只能從加強防腐能力和減少細菌入侵著手,如選擇合適的防腐體系、封閉良好的包裝。產品的微生物污染不僅影響產品的功能和穩定性,而且最重要的是影響使用時的安全性,使用污染了的產品會給消費者造成健康威脅，因此在化妝品中常添加不同種類的防腐劑來防止微生物的大量繁殖,化妝品中防腐劑的存在減少了微生物存在的幾率。

主要檢測方法

CTFA法

CIFA法用微生物包括:G+球菌如金黃色葡萄球菌;G-桿菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌;霉菌如黑曲霉、白色念珠菌。另外需氧產芽孢菌如蠟芽孢桿菌和枯草芽孢桿蘭等可選用。CIFA使用的細蘭培養基包括NA、TSA(水解大豆瓊開培養基)、EA(瓊脂培養基)。適宜于真蘭生長的培養包括PDA(馬鈴薯瓊脂培養基)或MA(瓊脂培養基)。當菌體生長好后,可將細菌或酵母菌于5℃下斜面保存,霉菌可在室溫下斜面保存。在準備接種物時,可以用肉湯或瓊培養基培養細菌和酵母菌,收獲的菌體用于微生物檢驗。在進行微生物檢驗時,一般取20g或20mL樣品,微生物的接種濃度控制在1x10°CUmL(或g)產物,眼部用品酵母菌和菌濃度1x10CFU/mL(或g)產物。為了獲得每種或每類群微生物的試臉數據,CTFA傾向于使用純培養物或相當類似的微生物來接種,體積不應超過總體積的1%,這些檢驗水平提供了比通常消費者使用可能性更高的細菌污染機會。加之,在產品設計時許多產品還有保護性體系,即加入略多一些的防腐劑,因此,大多數經檢驗后確定的防腐劑濃度保證了品可以在消費者使用期間抵抗污染。一般來講細菌的培養溫度為35-37℃,真菌采用23-28℃培養。CTFA推薦混合測試的樣品分別于0、1、23天(僅用于眼部的化妝品)、7、14和28天觀察微生物的生長情況，有部分檢驗可能多于28天。有些產品還進行重復性的防腐試驗來估計防腐劑在產中的適應性,用某一特定的微生物防腐試驗可以得出使防腐系統失去效力所需的檢驗次數。CTFA所推薦的含有中和劑的稀培養基有:LBL,LBLT,TGB或WB。當使用傾注平板法培養時,加人培養基中的卵磷脂或吐溫-80就可以中和大多數防腐劑,并使產品均勻分布,對細菌、酵母和真菌來講Letheen瓊脂培養基是最常使用的培養基,這種培養基還適用于厭氧菌的生長,對于中和季銨鹽類化合物十分有效。其他的CTFA推薦的培養基有:TSA、NA、,TA、EA、TCG-YEA、D-E培養基以及 TSAPL，其他還有使真菌富集的培養基,如右旋葡萄糖瓊脂, Mycophil瓊脂, Mycological瓊脂和 Eugen-gr。如果防腐劑是汞或其他重金屬,則應采用硫代乙醇酸的培養基。

USP法

USP所用的微生物包括:金黃色葡萄球菌(ATcC6538)、大腸桿菌(ATCC8739)、鋼綠假單胞菌(ATC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉( ATCC6404)。USP采用的培養基是SCDA(大豆酪蛋白消化性瓊脂培養),因為它可以使微生物旺盛地生長。故USP方法建議用此培養基來活化菌種。將保存的菌種在固體培養基上接種。細菌的培養在35℃下培養18~24h,酵母在20~25℃下培養48h,絲狀真菌在20-25℃下培養一周,菌種培養后用無菌生理鹽水收集細菌和酵母菌體,并將其稀釋到1×103cFU/mL,絲狀真菌用含0.05%吐溫-80的無菌水收集并將孢子濃度調至1×10CFUmL。由于菌懸液的濃度決定了試驗中的接種量,因此,應控制好菌液的濃度。另外,菌懸液制備好后應立即使用,否則將影響菌懸液中菌體的存活性。當產品的包裝容器不能進行接種和無菌取樣時,應取20mL的產品至一個無菌的帶蓋的細菌試管中,以0.01mL的接種液:20mL試驗樣品的比例進行接種接種液中的微生物濃度應控制在1x103-1×10°CF/mL之間,接種后在20~25℃下培養,微生物的計數采用平板計數法來確定。以這個數來計算產品中的初始菌體濃度。并于第7,14,28天分別進行檢測,并計算APC,試驗者可根據初始菌體濃度,計算出APC的變化。根據這種方法,一種有效的防腐體系可以在14天后將細菌生存數減至初始濃度的0.1%,酵母和霉菌生存水平可能會更低。在試驗后期階段,必須低于或維持這些既定的水平。

評價標準

USP認為如果產品能做到以下幾個方面就說明防腐劑系統有效：

1. 在14天內存活菌數達到初始菌數的0.1%;

2. 酵母菌和霉菌沒有菌絲生長;

3. 在28天保存試驗中所有測試的微生物都保持或低于所設計的微生物水平。

CTFA的評價標準認為如果產品能做到以下幾個方面,就說明防腐劑系統有效：

1. 在測試樣品保存7天內細菌營養細胞應減少99.9%以上,并在試驗期間繼續減少;

2. 酵母蘭和曹應減少90%以上,并在試驗期間繼續減;

3. 在整個試驗期間可抑制芽孢的萌發。

       上述兩種防腐效能試驗方法,為防腐效能試驗方法的選擇提供了參考,但防腐劑挑戰試驗在國際上并沒有統一的標準。結合找到實驗數據與實際情況的關聯,從企業的現狀選擇方法,不失為一種很好的選擇。